Grazie per aver visitato nature.com.Stai utilizzando una versione del browser con supporto limitato per i CSS.Per ottenere la migliore esperienza, ti consigliamo di utilizzare un browser più aggiornato (o disattivare la modalità di compatibilità in Internet Explorer).Nel frattempo, per garantire un supporto continuo, stiamo visualizzando il sito senza stili e JavaScript.Carosello con tre diapositive mostrate alla volta.Usa i pulsanti Precedente e Successivo per navigare tra tre diapositive alla volta o i pulsanti con i puntini alla fine per saltare tre diapositive alla volta.Reza Salehi, Hannah L. Mazier, … Benjamin K. TsangSomang Lee-Thacker, Hayce Jeon, … Misung JoJustin C. St. John, Yogeshwar Makanji, … Peter Temple-SmithFeixia Wang, Yifeng Liu, … Dan ZhangRan Liu, Hanni Ke, … Shidou ZhaoYongzhi Cao, Haibin Zhao, … Yueran ZhaoVijay Simha Baddela, Arpna Sharma, … Jens VanselowAsuka Okunomiya, Akihito Horie, … Masaki MandaiXing Li, Ling Zhou, … Min LongScientific Reports volume 13, Articolo numero: 2392 (2023 ) Cita questo articoloDopo l'ovulazione, l'enzima mitocondriale CYP11A1 scinde il colesterolo in pregnenolone per la sintesi del progesterone, suggerendo che le dinamiche mitocondriali svolgono un ruolo vitale nel sistema riproduttivo femminile.I cambiamenti nella dinamica dei mitocondri durante il ciclo ovarico sono stati riportati in letteratura, ma la correlazione con il suo ruolo nel ciclo ovarico rimane poco chiara.In questo studio, il promotore di fusione mitocondriale, M1, è stato utilizzato per studiare l'impatto della dinamica dei mitocondri nel sistema riproduttivo femminile.I nostri risultati hanno mostrato che il trattamento con M1 nei topi può portare all'interruzione dei cicli estrali negli strisci vaginali.La diminuzione dell'LH sierico è stata registrata nell'animale.E le inibizioni della secrezione di progesterone e delle ovulazioni sono state osservate nella coltura ovarica.Sebbene non siano stati osservati cambiamenti significativi nelle reti mitocondriali nelle ovaie, è stata rivelata una significativa up-regolazione dei complessi respiratori mitocondriali nei trattamenti M1 attraverso l'analisi trascrittomica.In contrasto con la biosintesi di estrogeni e steroidi sovraregolata in M1, le molecole della matrice extracellulare, gli enzimi di rimodellamento e le segnalazioni di adesione erano diminuite.Collettivamente, il nostro studio fornisce nuovi bersagli per regolare i cicli ovarici attraverso i mitocondri.Tuttavia, sono ancora necessari ulteriori studi per fornire le connessioni funzionali tra i mitocondri e i sistemi riproduttivi femminili.I mitocondri sono organelli dinamici.Oltre a fondersi e dividersi continuamente, vengono reclutati in posizioni specifiche all'interno delle cellule1.Con la loro struttura attiva, i mitocondri mantengono la loro forma, distribuzione e dimensione subendo cicli coordinati di fissione e fusione, indicati come dinamiche mitocondriali.La fissione e la fusione sono processi attivi che richiedono molte proteine ​​specializzate, compresi gli enzimi meccanici che alterano fisicamente le membrane mitocondriali e le proteine ​​adattatrici che regolano l'interazione di queste proteine ​​meccaniche con gli organelli1.La fusione aumenta il volume mitocondriale per una maggiore produzione di energia, mentre la fissione rimuove la popolazione disfunzionale che contiene proteine, membrane o mtDNA danneggiate.La dinamica funge quindi da meccanismo di controllo della qualità e della quantità per le popolazioni mitocondriali intracellulari2.Le transizioni dinamiche bilanciate sono necessarie per garantire la funzione mitocondriale e rispondere ai bisogni cellulari adattando la rete alla disponibilità di nutrienti e allo stato metabolico della cellula in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche3.I mitocondri potrebbero anche svolgere un ruolo fondamentale nella riproduzione femminile.Le cellule della granulosa ei mitocondri degli ovociti sono stati collegati alla qualità degli ovociti e all'invecchiamento ovarico4.Inoltre, ci sono prove di biogenesi mitocondriale nelle capre durante lo sviluppo follicolare5.Nelle formazioni luteiniche, mentre le cellule della granulosa proliferano e si differenziano nel corpo emorragico, nel nostro studio precedente sono stati osservati cambiamenti nella struttura mitocondriale6.Nei topi, il ciclo estrale dura 4-5 giorni e potrebbe essere suddiviso in proestro, estro, metestro e diestro dagli esami citologici degli strisci vaginali7.Generalmente, l'ovulazione potrebbe verificarsi la mattina dell'estro, dopo l'aumento dell'ormone luteinizzante (LH) nel tardo pomeriggio del proestro.In contrasto con l'elevazione dell'estradiolo prima del picco di LH, la sera del proestro si poteva registrare un aumento del livello di progesterone8.Gli impatti della dinamica mitocondriale sulle cellule steroidogeniche sono stati studiati in vari modelli, comprese le cellule di Leydig e le cellule luteali9,10.Anche i difetti nella proteina di fusione mitocondriale, Mitoguardin-1/2, mostrano un fenotipo subfertile nei topi femmina11.Tuttavia, sono ancora necessari ulteriori studi per chiarire le relazioni tra dinamica mitocondriale e cicli ovarici.Il promotore della fusione mitocondriale M1 è un composto di fenilidrazone permeabile alle cellule che ripristina la formazione della rete tubulare in vari tessuti e cellule, inclusi fibroblasti embrionali di topo12, iPSC umane13, cardiomiociti di ratto14, cellule PC1215, cellule T di topo isolate16, neuroni17 e tessuti cerebrali18.È stato riportato anche un aumento della capacità respiratoria di riserva mitocondriale, del tasso di consumo di ossigeno e dei geni dei complessi respiratori dopo i trattamenti M112,14,16.Considerando la mancanza di comprensione del ruolo che M1 svolge nei cicli ovarici e il ruolo delle dinamiche mitocondriali, l'attuale studio mira a indagare gli effetti del promotore di fusione mitocondriale M1 sulle funzioni ovariche del topo, utilizzando il promotore di fusione M1 per manipolare i mitocondri.Le funzioni ovariche dopo i trattamenti M1 sono state controllate attraverso lo striscio vaginale e il sequenziamento dell'RNA in topi femmina adulta.Mentre le reti mitocondriali 3D sono state controllate a livello ultrastrutturale, gli impatti diretti di M1 sull'ovaio sono stati studiati attraverso colture ovariche ex vivo.Per verificare se l'M1 può influire sulle funzioni ovariche, i cicli estrali di topi ICR di 8 settimane sono stati monitorati attraverso strisci vaginali giornalieri.Dopo che sono stati osservati cicli stabili, i topi in proestro sono stati trattati due volte al giorno con M1 per 10 giorni seguiti da un periodo di recupero senza iniezioni.Le osservazioni sui cambiamenti nei cicli di estro procedevano dallo striscio vaginale (Fig. 1a).Nei topi trattati con M1 al mattino del proestro (9:00), le interruzioni del ciclo sono state osservate proprio a mezzogiorno (12:00), quando i segni del diestro sono stati mostrati nello striscio (Fig. 1b).Man mano che le iniezioni continuavano, la fase diestro indotta da M1 si allungava ma i cicli venivano immediatamente recuperati dopo l'interruzione del trattamento (Fig. 1c).Le iniezioni di proestro M1 hanno temporaneamente interrotto il ciclo estrale del topo.Un gruppo di topi ICR di 8 settimane ha osservato il ciclo estrale mediante striscio vaginale per il monitoraggio del ciclo.Dopo che sono stati osservati due o più cicli, i topi sono stati trattati con trattamenti M1 o di controllo (n = 4) due volte al giorno per 10 giorni consecutivi e poi è stato osservato che i topi si riprendevano (a).La figura mostra il ciclo di estro dei topi prima, durante e dopo i trattamenti (b).Il ciclo dell'estro dei topi è stato osservato mediante strisci vaginali ed è stato mostrato il confronto degli strisci rappresentativi 3 ore dopo la prima iniezione di M1 (c).Il livello endocrino durante la fase del proestro nei topi è più fluttuante rispetto alle altre fasi.Ci sono eventi contrastanti che accadono durante i periodi di luce e buio della fase del proestro8.Considerando il tempo sufficiente per ottenere cambiamenti significativi nel trascrittoma e nell'analisi ormonale all'interno della stessa fase, i campioni di sangue sono stati raccolti la sera del proestro (20:00) dopo le seconde iniezioni della giornata (M1 e gruppo di controllo, Fig. 2a).Per dimostrare i cambiamenti nelle concentrazioni ormonali, i campioni di sangue sono stati raccolti anche la mattina (8:00) del proestro (P8).Al momento del campionamento, il livello sierico di progesterone del gruppo di controllo era superiore a quello del gruppo P8 (Fig. 2b) mentre l'LH sierico del gruppo M1 era inferiore agli altri (Fig. 2c).Inoltre, non vi erano differenze significative tra i gruppi nei livelli sierici di estradiolo (Fig. 2d).Sulla base delle maggiori variazioni dei livelli sierici di progesterone, il valore medio era inferiore al valore di controllo ma non raggiungeva la significatività statistica (P = 0,076, Fig. 2b).In questo studio si è tentato anche di controllare il livello sierico di FSH.Tuttavia, i livelli di FSH nel siero erano tutti al di sotto del limite di rilevabilità del sistema ELISA disponibile (dati non mostrati).Gli impatti dell'iniezione di M1 sul sistema endocrino.Topi ICR di otto settimane sono stati trattati con M1 alle 9:00 e alle 16:00 del giorno del proestro, i campioni di sangue sono stati raccolti la sera (20:00, a).Sono state misurate le concentrazioni di progesterone sierico (b), LH (c) ed estradiolo (d).I valori sono media ± SEM (n = 4–7).*Significatività statistica secondo il test t di Student, P <0,05.La microscopia elettronica è stata utilizzata per osservare e confrontare i mitocondri nell'ovaio dopo il trattamento M1.Per ciascun gruppo, i mitocondri nelle cellule della granulosa e della teca sono stati sottoposti a screening tramite immagini 2D (figura 3a).I mitocondri nelle cellule della granulosa mostravano creste lamellari, mentre i mitocondri nelle cellule della teca mostravano creste tubolari o vescicolari.I mitocondri a forma di bastoncino o globulare sono stati osservati in entrambi i tipi di cellule.Nessun cambiamento significativo nella struttura dei mitocondri è stato notato nel gruppo M1 (Fig. 3a).Per confermare la possibilità delle reti 3D nelle cellule, sono state eseguite la sezione seriale e la tomografia elettronica (Fig. 3b).Nella nostra indagine, non sono state osservate reti mitocondriali iperfuse o ramificate (Fig. 3c, d e Movie S1-S4).L'iniezione di M1 non ha modificato la rete mitocondriale delle cellule della granulosa e delle cellule della teca nei follicoli maturi.I campioni sono stati raccolti la sera (20:00) del proestro dopo la seconda M1 o iniezioni di controllo.La micrografia elettronica mostra i mitocondri a forma di bastoncino o globulare sia nelle cellule della granulosa che nelle cellule della teca (a).Il diagramma di flusso per le visualizzazioni delle reti mitocondriali 3D (b).Le reti mitocondriali 3D nelle cellule della teca di controllo (c) e M1 (d) sono state ricostruite attraverso la sezione seriale e la tomografia elettronica.Le creste mitocondriali sono state etichettate in colori opachi e le membrane esterne sono state etichettate in colori trasparenti.I mitocondri senza connessioni fisiche sono stati etichettati con colori diversi.Non sono stati osservati mitocondri evidenti di fusione o di ramificazione.Per chiarire il meccanismo di come M1 potrebbe interrompere il ciclo dell'estro, l'analisi del trascrittoma è stata eseguita sull'ovaio dopo il trattamento con M1 il giorno del proestro (20:00).In un totale di 6 campioni inviati, è stata ottenuta una media di 41,7 milioni di letture, dove il 97,02% delle letture è stato mappato con successo (90,68% mappato in modo univoco, Tabella S1).Sono stati ottenuti ed elencati 14.645 geni differenzialmente espressi (DEG) (Tabella S2).L'analisi dei componenti principali (PCA) tra i trattamenti M1 e Control ha rivelato una distribuzione raggruppata all'interno dei gruppi, mentre si potevano anche notare le variazioni nelle ripetizioni biologiche (Fig. 4a).L'iniezione di M1 ha promosso l'espressione dei geni dei complessi della catena respiratoria mitocondriale e ha soppresso i geni associati all'adesione cellulare nell'ovaio.Dopo M1 o trattamenti di controllo sul proestro, le ovaie sono state raccolte la sera (20:00) per l'analisi del trascrittoma (n = 3).L'analisi della componente principale 3D ha rivelato la somiglianza tra campioni e gruppi (a).Il grafico del vulcano ha mostrato la distribuzione dei geni espressi in modo differenziale con valori di regolazione P e cambiamenti di piega (b).I geni sono stati filtrati ed è stata eseguita l'analisi GO, i primi 25 termini GO (P <0,05) sono stati mostrati nel grafico a barre di confronto (c).I DEG sono stati filtrati per l'analisi del percorso GO e KEGG e, con le nostre impostazioni, sono stati ottenuti un totale di 245 DEG (134 down-regolati e 111 up-regolati nel gruppo M1, Fig. 4b).Nell'analisi GO, sono stati rivelati 41 termini di arricchimento significativi (regolare il valore P <0, 05), inclusi 12 nella componente cellulare (CC), 6 nella funzione molecolare (MF) e 23 nel processo biologico (BP, Tabella S3).29 dei termini di arricchimento significativi nel nostro confronto erano associati alla catena respiratoria mitocondriale, dove i membri dei geni erano sovraregolati nel gruppo M1, suggerendo gli effetti specifici di M1 sui mitocondri ovarici (Fig. 4c).D'altra parte, i geni down-regolati nel gruppo M1 potrebbero essere trovati nell'adesione cellula-substrato, nell'assemblaggio della giunzione aderente e nel costituente strutturale della matrice extracellulare (ECM) (Fig. 4c).Risultati simili potrebbero essere trovati anche nell'analisi del percorso KEGG (Tabella S4).In 14 dei 15 percorsi totalmente ottenuti, sono stati inclusi i geni nella catena respiratoria mitocondriale e la segnalazione dell'adesione focale.È interessante notare che la biosintesi degli steroidi è stata riconosciuta come un percorso significativamente up-regolato nel gruppo M1, dove 3 geni potevano essere ottenuti indipendentemente dagli altri percorsi (Tabella S4).Per studiare l'espressione genica in percorsi specifici, è stata eseguita l'analisi dell'arricchimento del set genico (GSEA) (Fig. 5).In 4604 set di geni analizzati dal database delle vie metaboliche del topo, sono stati ottenuti 586 set di geni significativi (regolare P <0, 25, Tabella S5).Simile alla nostra analisi GO e KEGG post-filtro, i principali set di geni attivati ​​(set di geni M1) includevano i membri della NADH deidrogenasi (es: NDUFA13, NDUFB8 e NDUFC1), il citocromo C ossidasi (COX5A) e la biosintesi degli steroidi (Fig. .5a).I membri dei migliori set di geni M1 hanno mostrato una distribuzione di rango focalizzata in set di dati ordinati (Fig. 5b).La maggiore coerenza di espressione tra gli individui potrebbe essere osservata nell'elenco dettagliato delle mappe di calore (Fig. 5c – e).I set di geni soppressi (set di geni di controllo) erano relativamente più grandi nel nostro studio, il che potrebbe essere riflesso da un numero di geni più elevato e da un rapporto genico inferiore (Fig. 5a).I set di geni di controllo superiore contenevano più membri sovrapposti, compresi quelli per le interazioni cellulari, la segnalazione, il citoscheletro, le molecole ECM e gli enzimi di rimodellamento, che potevano essere identificati (Fig. 5b; Tabella S5; Fig. S1).I set di geni associati alla maturazione degli ovociti mediata dal progesterone (percorso KEGG mmu04914) e alla sintesi di estrogeni sono stati ottenuti anche nei nostri risultati GSEA (Fig. 5b; Fig. S2a).Con tassi di falsa scoperta più elevati (FDR, regolare P = 0,0967 e 0,1451, rispettivamente), i set di geni del progesterone sono stati soppressi nei trattamenti M1 (Fig. 5f), mentre il percorso della sintesi degli estrogeni è stato attivato nei trattamenti M1 (Fig. S2b) .Le significative vie metaboliche dopo i trattamenti M1 sono state rivelate nell'analisi di arricchimento del set genico (GSEA).I geni identificati come sovraespressi sono stati classificati attraverso il dot plot GSEA (a) e il plot GSEA (b).I dettagli delle espressioni geniche per NDUFA13 (c) COX5A (d), mappa di calore del percorso di biosintesi degli steroidi (e) e maturazione degli ovociti mediata dal progesterone (f) sono stati mostrati nelle mappe di calore.I livelli di espressione sono stati normalizzati e mostrati come espressioni logaritmiche relative (RLE).La tempistica del ciclo potrebbe avere variazioni più elevate e complessità sistemiche tra i singoli animali.Per semplificare i fattori e osservare l'impatto diretto della M1 sull'ovaio, sono state eseguite colture di tessuto ovarico.I trattamenti sono stati somministrati attraverso il terreno di coltura accompagnato da livelli ormonali coerenti (Fig. 6a).Al fine di manipolare le dinamiche mitocondriali durante la transizione tra le fasi follicolare e luteinica, sono stati somministrati contemporaneamente il trattamento M1 e il mezzo B (alto LH).Durante i periodi di coltura, il terreno di coltura è stato raccolto giornalmente per accedere alle funzioni steroidogeniche.La concentrazione di estradiolo era al di sotto dei limiti di rilevamento nel nostro sistema, quindi sono stati presentati solo i livelli medi di progesterone (Fig. 6b, c).Mentre il livello elevato di progesterone potrebbe essere rilevato dopo la stimolazione LH di controllo il giorno 5 e il giorno 10 (Fig. 6b), la combinazione del trattamento LH e M1 ha comportato una ridotta secrezione di progesterone medio (Fig. 6c).In linea con la riduzione del livello medio di progesterone, è stato ridotto anche il numero di ovociti recuperati dal trattamento M1 (Fig. 6d).M1 ha soppresso la secrezione di progesterone e il rilascio di ovociti durante la stimolazione con LH nelle colture di organi ovarici.Le ovaie di topo al proestro sono state coltivate nel mezzo contenente FSH e LH per imitare il ciclo dell'estro (a).Le concentrazioni di progesterone nel mezzo sono state analizzate nei gruppi di controllo (b) e M1 (c).È stato anche contato il numero di ovociti recuperati dalla coltura ovarica (d).I valori sono media ± SEM (n = 3–4 per ciascun gruppo).* Significatività statistica rispetto al controllo nello stesso giorno, P < 0,05, test t di Student.I mitocondri nelle cellule animali formano una rete altamente dinamica in condizioni fisiologiche.I mitocondri subiscono continuamente biogenesi, fissione, fusione, mitofagia e motilità19.Le dinamiche mitocondriali differiscono nei diversi tipi di cellule e soddisfano le esigenze funzionali specifiche della cellula.I mitocondri sono coinvolti nell'apoptosi, nella produzione di ATP e nella steroidogenesi nel sistema riproduttivo femminile20.Nel lignaggio delle grandi cellule lutei di capra, sono stati notati significativi cambiamenti di massa e forma dei mitocondri durante la transizione dal follicolo maturo al corpo luteo6.Tuttavia, gli impatti e i meccanismi regolatori delle dinamiche mitocondriali nel ciclo ovarico rimangono irrisolti.In questo lavoro, proponiamo un nuovo meccanismo mediante il quale la promozione della fusione mitocondriale può influenzare il ciclo ovarico alterando la funzione mitocondriale e la produzione di ormoni steroidei.La durata regolare riportata del ciclo estrale del roditore è di 4-5 giorni, che è stata presentata anche nel gruppo di controllo del nostro studio8,21.Il regolare ciclo estrale è un indicatore della successiva ovulazione, la cui ciclicità è risultata interrotta nel topo durante dieci giorni di esposizione a M1 e recuperata dopo l'interruzione del trattamento, suggerendo che l'M1 potrebbe avere un impatto lieve e reversibile sull'apparato riproduttivo femminile sistema del mouse.All'inizio dei trattamenti M1, la fase di proestro confermata è stata modificata nella fase diestro 3 ore dopo la prima iniezione di M1, suggerendo una risposta acuta del sistema riproduttivo all'esposizione di M1.Gli ormoni steroidei come gli estrogeni e il progesterone potrebbero regolare la crescita delle cellule epiteliali vaginali, l'infiltrazione dei leucociti e le secrezioni di muco7,22,23,24.Nei roditori, lo stadio con il più alto livello di progesterone sierico è stato riportato in letteratura come incoerente, variando da tardo proestro, estro e diestro25,26,27.Ciò potrebbe essere dovuto alla variazione e ai drammatici cambiamenti negli eventi riproduttivi nei roditori.In studi recenti, la più bassa concentrazione di progesterone è stata riscontrata durante il diestro, mentre l'aumento del progesterone si è verificato durante il proestro o la fase dell'estro25,26.Il picco di LH è previsto anche nel tardo proestro, sebbene la finestra temporale esatta sia difficile da osservare28.Nel nostro studio, il progesterone era elevato alla sera del proestro, il che è coerente con i precedenti rapporti sui ratti26.L'iniezione di M1 ha provocato un'ambigua riduzione del progesterone sierico, che potrebbe riflettere la complessità degli eventi fisiologici nel giorno del proestro del roditore.L'LH ha mostrato un livello simile tra il proestro mattina e sera nel gruppo di controllo, suggerendo che il livello di LH potrebbe riflettere il livello di secrezione basale attraverso il nostro programma di campionamento8.L'LH era inferiore nel gruppo M1.Tali cambiamenti potrebbero prendere parte alla segnalazione delle cellule ovariche.Tuttavia, poiché la comparsa del picco di LH o dell'ovulazione deve ancora essere confermata in vivo dopo i trattamenti con M1, rimangono necessari ulteriori campionamenti e osservazioni per valutare gli impatti di M1 nei topi femmina.Come è stato mostrato nel nostro risultato, l'inibizione endocrina nei topi trattati con M1 potrebbe essere simile alle condizioni ormonali nella fase diestro e portare al risultato diestro nello striscio vaginale dopo le iniezioni di M1.Nel nostro studio precedente, i mitocondri allungati con rami potevano essere trovati nelle cellule della granulosa, scomposte alla luteinizzazione nelle capre6.Tuttavia, i tempi dettagliati per lo spostamento delle dinamiche mitocondriali all'ovulazione rimangono non disponibili.Poiché l'aumento della fusione mitocondriale potrebbe portare alla formazione di reti di ramificazione iperfuse, ci siamo concentrati sulla formazione di reti mitocondriali nelle cellule ovariche dopo i trattamenti M1.Nei topi, le reti mitocondriali osservate nel tardo proestro mostravano già uno schema frammentato nelle cellule della granulosa dei follicoli maturi.Tuttavia, la definizione dello stadio del ciclo e degli eventi cellulari potrebbe essere incoerente tra roditori e altri mammiferi.Nelle cellule della teca interna, i mitocondri allungati sono stati notati dopo i trattamenti M1 nella nostra analisi ultrastrutturale 3D.Tuttavia, caratteristiche simili potrebbero essere osservate anche nel gruppo di controllo durante lo screening 2D.Nonostante M1 sembri promuovere la fusione mitocondriale in vari modelli12,13,14,15,16,17,18, l'iniezione di M1 non ha modificato la rete mitocondriale nelle cellule della granulosa di topo e nelle cellule della teca interna.Ciò potrebbe essere causato dal farmaco somministrato in condizioni fisiologiche nel nostro studio, dove un'omeostasi potrebbe essere mantenuta sotto il meccanismo della dinamica mitocondriale.Nelle cellule T di topo, la fusione mitocondriale è stata promossa da trattamenti simultanei di M1 e dell'inibitore di fissione, Mdivi-1, suggerendo che la combinazione di più modulatori potrebbe essere necessaria per modificare le reti mitocondriali16.Nei ratti, i cambiamenti nei livelli proteici della proteina 1 correlata alla dinamina (Drp1), la proteina di fissione dei mitocondri, aumentavano gradualmente dal proestro al massimo durante il diestro29.Poiché i mitocondri hanno mostrato una distribuzione disomogenea nelle cellule e le ovaie erano composte da follicoli in crescita, cellule interstiziali e corpo luteo nei roditori, potrebbero essere necessarie colorazioni specifiche o isolamento cellulare per una quantificazione efficace e un'osservazione strutturale per correlare le dinamiche mitocondriali tra le cellule ovariche .Poiché il ciclo sta cambiando più velocemente nei roditori, potrebbero essere necessari tempi di campionamento più frequenti per ogni fase del ciclo estrale.Sebbene le reti mitocondriali siano state mantenute, nell'analisi del trascrittoma dopo i trattamenti M1 sono state rivelate espressioni crescenti di complessi respiratori mitocondriali, suggerendo che M1 potrebbe influenzare il ciclo ovarico senza modificare completamente la forma mitocondriale nelle cellule ovariche.In letteratura sono state riportate anche sovraregolazioni indotte da M1 dei complessi respiratori mitocondriali, suggerendo un impatto specifico di M1 sui mitocondri ovarici12.Per la produzione di ormoni steroidei, i percorsi della biosintesi degli steroidi e degli estrogeni erano sovraregolati nel gruppo M1.Poiché le concentrazioni di estradiolo sierico rimangono costanti tra i gruppi, le sovraregolazioni dell'mRNA potrebbero riflettere le prime risposte delle cellule steroidogeniche in un periodo relativamente breve (11 ore dalla prima iniezione di M1).Tuttavia, i meccanismi per l'up-regulation dei percorsi attendono ulteriori studi.D'altra parte, la sottoregolazione dei membri nella maturazione degli ovociti mediata dal progesterone potrebbe riflettere le inibizioni del meccanismo per lo sviluppo degli ovociti nell'organo, accompagnata dalla sottoregolazione delle molecole ECM, degli enzimi di rimodellamento e della segnalazione di adesione sotto trattamenti M1.Nelle ovaie di topo in coltura, è stato dimostrato che l'apporto appropriato di progesterone aumenta la crescita del follicolo e il rilascio di ovociti30.I nostri risultati hanno suggerito che i trattamenti M1 potrebbero causare il ristagno del rimodellamento dell'ECM e la crescita del follicolo.Nel nostro studio non sono stati osservati percorsi di apoptosi né atresia follicolare.Poiché ci siamo concentrati sull'impatto acuto di M1 sui tessuti ovarici, sono ancora necessari studi più dettagliati per chiarire il decorso temporale delle risposte ovariche ai trattamenti M1.Sebbene le espressioni geniche possano essere regolate dall'LH nella nostra analisi del trascrittoma, l'inibizione della sintesi del progesterone e dell'ovulazione è stata evidenziata nelle colture ex vivo dopo i trattamenti con M1, suggerendo che un contributo diretto di M1 potrebbe verificarsi nelle ovaie.Le espressioni dell'enzima produttore di progesterone, HSD3B, sono state evidenziate anche nella teca interna, nelle cellule interstiziali e nel corpo luteo, suggerendo le molteplici fonti di progesterone nel topo31.Tuttavia, le cellule sotto inibizioni M1 devono ancora essere identificate in ulteriori studi.Nel nostro studio ex vivo, sebbene l'inibizione della sintesi del progesterone e del rilascio di ovociti abbia mostrato coerenza con i nostri studi in vivo, il dosaggio di M1 potrebbe non causare la risposta attraverso percorsi identici tra i modelli.Nelle cellule steroidogeniche in coltura, la promozione o l'inibizione della steroidogenesi potrebbe dipendere dal dosaggio dell'inibitore della fissione mitocondriale, Mdivi-110.Poiché le informazioni dettagliate sulla coltura degli organi devono ancora essere stabilite.Sono stati necessari ulteriori esperimenti per confermare le relazioni dettagliate tra i vari modelli.I mitocondri potrebbero fungere da punto di articolazione per le cellule steroidogeniche nei sistemi riproduttivi.In quanto sede delle reazioni enzimatiche steroidogeniche, i mitocondri devono bilanciare le loro funzioni.Nelle cellule MA-10, è stato dimostrato che la stimolazione del cAMP aumenta la respirazione cellulare e il potenziale della membrana mitocondriale32.Le inibizioni del trasporto di elettroni, le interruzioni dei valori di pH intramitocondriale o le dissipazioni del potenziale di membrana mitocondriale erano sufficienti a provocare una diminuzione della produzione di progesterone indipendentemente dalle attività degli enzimi steroidogenici mitocondriali32.Mentre la biogenesi mitocondriale indotta dallo stress è stata evidenziata nelle cellule di Leydig dei ratti33, i cambiamenti del ciclo estrale sono stati collegati a fattori ambientali34,35.Ad esempio, una fase diestro prolungata potrebbe essere riscontrata nel ratto dopo sette giorni di esposizione all'ipossia36.A nostra conoscenza, il promotore della fusione mitocondriale, M1, è stato segnalato per la prima volta per interferire con le funzioni dei sistemi riproduttivi femminili nel nostro studio.Sebbene i profili di espressione genica abbiano mostrato una risposta specifica a M1 nei mitocondri ovarici, sono necessari più collegamenti tra mitocondri e funzioni ovariche.In conclusione, gli effetti di M1 nel tardo proestro hanno fatto sì che lo striscio vaginale imitasse lo stadio del diestro.Nell'ovaio, M1 potrebbe portare all'inibizione del rimodellamento dell'ECM e dei segnali di adesione cellulare, che è accompagnato da una diminuzione dell'LH sierico e del progesterone.La crescita follicolare inibita potrebbe portare a un numero inferiore di ovociti ovulati dopo i trattamenti M1.Sebbene i trattamenti M1 promuovano l'espressione dei complessi respiratori mitocondriali, il trattamento non ha potuto modificare la forma dei mitocondri nelle cellule steroidogeniche dei follicoli maturi.Restano necessari studi più dettagliati per chiarire il ruolo della dinamica mitocondriale nei cicli ovarici.In questo studio, topi ICR femmina di 8 settimane (ottenuti da BioLASCO) con un peso medio di 25 g sono stati alloggiati a 25 ± 2 ℃, con un'umidità relativa di circa il 50-60% e 12 ore di luce/12 ore ciclo oscuro.Le diete e l'acqua sono liberamente accessibili.I topi sono stati acclimatati per due settimane prima dell'inizio dei trattamenti e messi in gabbie secondo i loro gruppi sperimentali.Nella stessa stanza sono stati presentati anche i maschi per esaltare i cicli regolari7.Ogni gabbia conteneva 4-6 topi ed era provvista di arricchimento (es. tubo di plastica, carta triturata, ecc.).Le gabbie venivano pulite e controllate ogni settimana.Dopo il trattamento, i topi sono stati anestetizzati con avertina al 2,5% (0,15 mL/10 g) mediante iniezione intraperitoneale e sacrificati mediante dislocazione cervicale.Tutti i metodi sono stati eseguiti anche in conformità con le linee guida ARRIVE.Tutte le operazioni e l'utilizzo degli animali seguivano la Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (pubblicazioni NIH n. 108-EL-00112).Il ciclo di estro del topo è stato determinato da uno striscio vaginale giornaliero.Per raccogliere le cellule per gli esami, sono stati eseguiti lavaggi vaginali irrigando la vagina con 100 µl di acqua salina.Le cellule raccolte nella soluzione sono state disperse su un vetrino e colorate con blu di toluidina O (TBO)7.Dopo che sono stati osservati 2 cicli regolari, sono stati condotti ulteriori strisci alle 8:00 del giorno del previsto proestro.Il trattamento di 10 giorni M1 (SI-SML0629, Sigma-Aldrich, 1 mg/ml in 5% DMSO/10% Tween80/85% 1xPBS solution, 10 mg/kg BW) è stato somministrato dopo che il topo è stato assicurato nella fase del proestro .Il trattamento M1 è stato somministrato alle 9:00 e alle 16:00 tramite iniezioni IP.Alle 12:00 è stato continuato uno striscio vaginale giornaliero per osservare l'impatto del trattamento.Per osservare l'impatto più lungo del farmaco, i trattamenti di 10 giorni e lo striscio vaginale sono stati eseguiti secondo lo stesso programma di trattamento.Mentre per osservare l'impatto acuto del farmaco, è stato eseguito il trattamento M1 di 1 giorno utilizzando lo stesso programma di trattamento e striscio vaginale.I sieri e le ovaie sono stati raccolti prima (8:00, P8) e dopo i trattamenti (20:00, M1 o controllo).Le ovaie di ciascun gruppo sono state campionate per l'osservazione al microscopio elettronico (n = 4 per ciascun gruppo) e per il sequenziamento di nuova generazione (n = 3 per ciascun gruppo).Allo stesso tempo, i sieri sono stati raccolti per eseguire i test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per le concentrazioni di ormoni.La concentrazione di progesterone nel siero e nel mezzo di coltura del tessuto ovarico dei topi in ogni fase è stata misurata utilizzando un ELISA per il progesterone stabilito nel nostro laboratorio37.Il siero e l'estradiolo medio sono stati misurati utilizzando il kit Mouse Estrogen ELISA (ab285291, Abcam), mentre l'LH sierico è stato misurato utilizzando il kit ELISA per l'ormone luteinizzante del topo (CEA441Mu, Cloud-Clone Corp., USA).Tutti gli standard e i campioni sono stati analizzati in duplicato.Il t-test di Student è stato eseguito per identificare differenze significative (P <0,05) tra i gruppi.Dopo il campionamento, le ovaie sono state immediatamente immerse in fissativo preraffreddato contenente il 4% (p/v) di paraformaldeide (PFA) e il 2,5% (p/v) di glutaraldeide (GA) in tampone fosfato di sodio 0,1 M (PB, pH 7,3).I tessuti sono stati quindi sezionati e tagliati in piccoli cubetti (< 1 mm3) nel fissativo.I tessuti sono stati fissati durante la notte a 4 ° C e ulteriormente sottoposti a un protocollo standard di post-fissazione (tetrossido di osmio all'1% in 0,1 M PB per 90 minuti), disidratazione e inclusione (mezzo di Spurr).Sezioni semisottili.(500 nm) sono stati tagliati e colorati con TBO per microscopia ottica.I follicoli antrali maturi senza segni di atresia sono stati selezionati per ulteriori osservazioni.Sezioni ultrasottili sono state raccolte sulle griglie delle fessure di rame con pellicole di supporto in carbonio e le griglie sono state colorate con citrato di piombo di Reynold per 4 minuti.Le immagini 2D dei mitocondri sono state acquisite utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione (TEM, FEI Tecnai G2 TF20 Super TWIN) operante a 120 kV.Per lo screening del campione, sono stati osservati almeno 3 blocchi di individui diversi per ciascun gruppo.Per la tomografia elettronica, seriale Sez.(200 nm) attraverso le cellule bersaglio38.La tomografia elettronica a doppia inclinazione è stata eseguita con un FEI Tecnai TEM funzionante a 200 kV.Chim.Int.Nat.Nat.Sono.Nat.Nat.